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猪流感病毒分子生物学诊断方法进展
摘 要 猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性、高度接触传染性猪传染病,对养猪业危害极大,猪流感病毒也可感染人类,对人类的生命健康造成威胁.文章综述了猪流感病毒分子生物学诊断的几种方法,主要包括核酸探针、RT-PCR 方法、多重RT-PCR 方法、荧光定量定量RT-PCR 方法、环介导等温扩增方法,对猪流感的诊断和防控具有一定的参考价值.
关键词 猪流感病毒；分子生物学；诊断
猪流感(swine influenza,SI) 是由猪流感病毒(swine influenzirus,SIV) 引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病.该病有明显的季节性,深秋、早春和冬季多发,各种年龄、性别和品种的猪均易感[1],临床上主要表现为发病急、呼吸困难、咳嗽、流泪、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[2].SIV 可损害猪的免疫系统,引起免疫抑制,继发感染其他疫病,加剧病情,降低生产性能,给养猪业造成巨大的经济损失.SIV 是正黏病毒科流感病毒属病毒,核酸为单股负链RNA,基因组长13.6kb,由大小不等的8 个独立片段组成.SI 在世界各地广泛存在[3],目前,已经分离的血清型有H1N1、H1N2、H2N3、H3N1、H 3 N 2 、H 1 N 7 、H 3 N 6 、H 4 N 6 、H5N1 和H9N2 等, 在我国猪群中流行较广的主要是H1N1、H1N2 和H3N2, 也有H5N1 和H9N2 感染猪的相关报道[4~5].由于猪呼吸道内同时具有人流感和禽流感的唾液酸受体,因此,猪是禽、猪、人流感病毒共同易感宿主,是流感病毒基因重组或重配的“混合器”[6],猪流感的公共卫生学意义日益突出,在流感大流行中起着重要的作用[7].2009 年3 月,墨西哥和美国等先后发生人感染猪流感病毒,为A 型流感病毒,H1N1 亚型猪流感病毒毒株,是一种新型SIV,可以在人群中普遍传播.2015 年,猪流感袭击印度,造成3.1 万人患病,其中超过1,800 人死亡.2016 年年初开始,在俄罗斯已经有200 余人死于流感,大多数死者被化验出感染了H1N1 甲型SIV.本文就近年来猪流感病毒的分子生物学检测方法研究进展进行综述,以期为SI 的快速诊断和防控提供参考.
1 核酸探针
核酸探针技术是常用的分子生物学诊断技术,具有操作简单,不受抗原抗体反应的限制,结果易于判定等优点.Junk 等用非放射性地高辛标记的582 个碱基cDNA 探针来检测A 型H1N1 SIV 编码核蛋白的RNA,阳性细胞呈明显的暗黑色,证明该探针有较好的特异性和敏感性.吕翠等[8] 以地高辛标记SIV 基质蛋白(M) 基因的保守片段制成核酸探针,与H1 及H3亚型的SIV 的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型的DNA、猪瘟病毒cDNA、猪伪狂犬病的DNA 进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1 及H3 亚型的SIV 的cDNA 杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性,敏感性试验显示,探针最低能检出约5pg 的H3亚型的SIV RT-PCR 产物,应用该探针对35 份疑似SI 临床病料进行检测,结果检出9 份阳性,与RT-PCR 检测结果一致.
2 RT-PCR 方法
RT-PCR 是以病毒的RNA 为模板进行反转录,再以PCR 进行核酸扩增来检测病毒的方法,以其简便、迅速、灵敏等优点在动物疾病诊断上得到了广泛的应用.杨焕良等[9] 根据SIV M 基因序列设计了一对引物,建立了RT-PCR 快速诊断SI 的方法,可特异性扩增M 基因684bp 片段,采用该方法检测出H1、H3、H5 和H9 等4 个亚型SIV 标准参考株为阳性,猪副黏病毒、猪圆环病毒2 型和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果呈阴性.RT-PCR 最少可检测到103ID50 的病毒核酸,可直接从SIV 感染小鼠的组织样品中检测到病毒.吕翠等[10] 根据SIV M 基因的序列,设计1 对引物,建立了检测猪流感的RT-PCR 方法.应用该法对H1、H3、H9 亚型的猪流感病毒进行基因扩增,均获得了分子量为460bp 的特异性目的片段,而对PRRSV、PCV2、PRV、CV 进行同条件检测,结果均为阴性,SIV 扩增产物测序结果与SIV 其他毒株序列同源性达99%~100%.敏感性试验表明,该方法可检测到103EID50 的SIV,可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.王隆柏等[11] 根据GenBank 发表H1N1、H1N2 和H3N2亚型猪流感病毒M 基因片段的引物序列,设计合成1 对引物,建立猪流感病毒RT-PCR 检测方法.结果显示,该法能扩增出675bp 的基因片段,同条件扩增伪狂犬病毒、猪瘟病毒、圆环病毒Ⅱ型及猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性,可检测到3.5pg 猪流感的核酸,能从被流感病毒感染的小白鼠和疑似猪流感的病料中检测到SIV.
3 多重RT-PCR 方法
多重PCR 是在单一PCR 基础上发展起来的新技术,通过寡核普酸引物组合,在一个PCR 反应体系中同时扩增多个靶序列,其扩增的特异性和效率与单一PCR 相当,但同时可扩增针对不同模板的多个靶序列,能节约时问和精力.罗俊等[12] 根据GenBank登录的SIV M 基因序列和猪呼吸与繁殖综合征病毒美洲型毒株的N 基因序列,设计2 对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立了可同时检测这两种病毒的双重RT-PCR 方法,对这两种病毒的扩增大小分别为345bp 和520bp,特异性试验结果显示,对猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2 型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性,对SIV 和猪呼吸与繁殖综合征病毒美洲型毒株两种病毒混合液的最小检出量分别为102EID50/0.1mL 和103TCID50/0.1mL.齐海涛等[13] 根据GenBank 中H1N1和H3N2 亚型SIV 血凝素、神经氨酸酶和M 基因保守序列,分别设计合成了5 对特异性引物,利用RT-PCR 技术对SIV 的型和亚型进行鉴定.结果表明,该方法的型RT-PCR 可以检测出104EID50 病毒量所提取的RNA,H1、H3、N1 和N2 的亚型RT-PCR均可以检测出104EID50 病毒量所提取的RNA.除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%.王洪光等[14] 根据GenBank 登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以猪繁殖与呼吸综合征病毒与SIV 的RT-PCR 诊断方法,扩增的目的片段长度分别为364bp和981bp.通过试验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对猪繁殖与呼吸综合征病毒和SIV 的核酸检测最低浓度分别为3.2×10-3ng 和2.7×10-3ng.应用该方法对32 份临床样品进行检测发现,猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性率为43.8%,SIV 阳性率为31.3%,二重感染率为9.4%.该方法的成功建立为快速高效地检测以上2 种病毒提供了有力手段.韦冠东等[15] 根据GenBank 登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒与SIV 的三重RT-PCR 诊断方法,扩增的目的片段长度分别为364bp、530bp 和981bp.通过试验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和SIV 的核酸检测最低浓度分别为3.2×10-2ng、8.3×10-2ng 和3.7×10-2ng.
4 荧光定量RT-PCR 方法实时荧光定量PCR 是在PCR 技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,它融汇了传统PCR 技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点.郭泗虎等[16] 根据GenBank 中登录的H3 亚型SIV 血凝素基因的保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了一种检测H3 亚型SIV 的SYBRGreen Ⅰ荧光定量检测方法,并进行灵敏度、稳定性和特异性试验,与普通PCR 进行比较.研究结果表明,标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,R2 为0.994,CV 为0.17%~1.41%,具有良好的稳定性.除H3 亚型SIV 外,对H1、H4、H6、H9 亚型SIV 以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒和猪圆环病毒2 型的检测均为阴性,与普通PCR 相比更灵敏.张太翔等[17] 选取SIV 的核蛋白基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV 的TaqMan 实时荧光定量PCR 方法.以梯度稀释的含有SIV 目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR 反应以确定检测灵敏度.在2.0×108 ～ 2.0×102 拷贝/μL 的7 个数量级的范围内定量PCR有“S”型扩增曲线,检测灵敏度为20 个拷贝/μL,并根据病毒拷贝数与Ct 值的关系绘制了标准曲线.该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应.刘好朋等[18] 根据H1 亚型SIV 血凝素基因保守序列,分别设计并合成1 对特异性引物和1 条TaqMan MGB 探针,建立检测H1 亚型SIV 的一步法实时荧光定量RT-PCR 技术.结果显示,该方法的敏感性可达102 拷贝/μL,除H1 亚型SIV 外,对H3N2 亚型SIV、H9N1 亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF 鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%.王建华等[19]分别根据尼帕病毒(NiV) 和SIV 的M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV 和SIV 的双重实时荧光定量RT-PCR 检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用.结果显示,用该方法检测NiVM 基因的RNA 标准对照(NiV-M-RNA) 和SIVM 基因的RNA 标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101 ～ 4.6×108拷贝/μL 和5.8×101 ～ 5.8×108 拷贝/μL,检出限分别为46 个拷贝和58 个拷贝.该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性.该方法仅对NiVM-RNA 和SIV 呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒、猪流行腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2 型和伪狂犬病病毒发生交叉反应.
5 环介导等温扩增技术
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP) 方法是日本学者Notomi 等发明的一项恒温核酸扩增技术,具有操作简便、快速、敏感、特异等特点,特别适合在现场和基层部门应用.刘中勇等[20]根据GenBank 中收录的H3N2 亚型SIV 血凝素基因保守区的序列,设计一组对应血凝素基因序列6 个区域的4 条特异性引物,基于RT-LAMP 的H3 亚型SIV 快速检测的方法.扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视.同时用特异性内切酶Hha Ⅰ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合.用已建立的RT-LAMP 技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR 方法符合率均达到100%.苏霞等[21] 从GenBank 中获得H1N1 SIV 血凝素、神经氨酸酶基因序列,应用DNAStar软件MegAlign 程序分析其序列,利用Primer ExplorerV4 软件在序列保守区域设计LAMP 引物,即外引物和内引物,同时以H1N1 SIV 的cDNA 作为阳性模板,对试验中的几个反应条件进行优化.建立H1N1 SIV LAMP 快速检测方法.结果显示,该法对H1N1SIV 的灵敏度达到4~6 个拷贝,其引物对于H9 亚型禽流感病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒均无非特异性扩增,表现出良好的特异性.张莉等[22] 针对SIV NP 基因保守区域设计并合成6 条引物,建立了SIV 的LAMP 检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1 亚型SIV 及甲型H1N1 流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2 型、日本乙型脑炎病毒,该方法的最低检测量为100 拷贝/μL质粒DNA.
6 小结与展望
虽然目前已经建立了多种SIV 分子生物学诊断方法,在临床SI 的诊断中起到了一定作用,但这些方法都有利有弊,如常规RT-PCR 方法敏感性不够高,可能造成漏检,且不能实现对病毒的定量检测,荧光定量RTPCR方法立刻弥补常规RT-PCR 的缺点,但对人员和设备仪器要求太高,不适合兽医基层单位大规模推广和应用.LAMP 方法检测快速、简便,适合在基层兽医和养殖场进行推广使用,但容易出现假阳性结果,随着分子生物学技术的不断发展,目前对其他病毒病的检测方面已经研制出了基因试纸卡检测盒,具有LAMP 检测方法的优点,又能避免假阳性的出现,适合基层兽医部门应用,更方便、实用,笔者认为基因试纸卡是未来SIV 检测试剂的研究方向.
分子生物学论文范文结:
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