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超声波辅助的植物转化方法进展
王建军, 冯莉赟, 申虎飞, 刘 佼
（山西农业科学院隰县农业试验站, 山西隰县 041399）
摘 要： 为了探索超声波处理在植物转化中的功效及潜在发展能力, 从超声波辅助植物转化的原理入手,归纳了方法的验证、 超声波处理的受体材料和超声波处理对外源DNA的影响； 总结了前人在超声波辅助植物转化方面的研究进展, 进而分析了方法自身的优缺点及存在问题.指出超声波辅助植物转化方法虽然处于初级发展阶段, 但超声波辅助的植物转化仍然是一个操作简单、 省时省力、 适用范围广的植物转化方法, 文中还提出了存在的问题且给出了相应的解决对策； 通过分析认为超声波辅助的植物转化方法具有广阔的发展前景.
关键词： 超声波； 辅助； 植物； 转化方法
中图分类号： Q812 文献标志码： A 论文编号： cjas16120034
基金项目： 国家转基因重大专项 “抗病虫、 抗除草剂转基因玉米新品种选育” (2016ZX08003001-002-003)； 山西省科技攻关项目 “多抗耐密型玉米新种质创制及新品种选育” (20140311002-1).
第一作者简介： 王建军, 男, 1972年出生, 副研究员, 本科, 学士, 主要从事作物遗传育种工作.通信地址： 041399 山西省隰县龙泉镇下王家庄村164号 山西农业科学院隰县农业试验站, Tel： 0357-7321591, E-mail： wangjianjun1123@126.com.
收稿日期： 2016-12-29, 修回日期： 2017-02-06.
0 引言
植物转基因研究已有30多年的历史, 自从1983年第一例转基因烟草植物问世以来 [1] , 转基因植物的新品种培育及其产业化的发展非常迅速、 趋势向好.目前,植物转基因的方法有农杆菌介导法 [2] 、 基因法 [3] 、 花粉管通道法 [4] 、 PEG介导法 [5] 、 电激穿孔法 [6] 、 电泳法 [7] 、 激光微束法 [8] 等, 其中全球通用的, 也是应用较多的是前3种方法.虽然这些方法各有特点, 并在植物转基因研究中做出了很大贡献, 但这些方法仍然存在不同程度的缺陷, 如有些方法过程冗长、 操作繁琐, 有些方法受限于植物的基因型, 一些化学转化方法可能产生细胞毒害, 特别是一些转化方法还需要贵重精密的设备等.为了能开发出一种既能克服这些缺陷又能提高转化效率的植物转化方法, 众多学者进行了大量的研究工作, 超声波介导的植物遗传转化方法就是其中成功的一例.
超声波是一种频率高于20000 Hz的声波, 特点是直线传播、 能量大.由于其特有的机械效应、 空化效应和生物学效应等, 应用范围十分广阔.英国学者Rayleigh [9] 于1917年发表的论文 《液体中球形空穴崩溃时产生的压力》 为今天根据超声波原理设计各种仪器设备并应用于医学、 工业和分子生物学研究提供了重要的理论依据.也正是基于这种理论, 超声波被用来辅助其他动植物的转化方法, 试图能以此来解决植物转化过程中的基因型依赖性、 转化效率低等难题.
周光宇 [4] 根据远缘杂交现象, 提出了DN段杂交理论, 使外源DNA导入植物细胞并产生变异后代有了理论依据.1990年许宁等 [10] 根据超声波的作用原理, 提出 “超声诱导基因转移” 方法, 并在小麦幼胚和动物细胞上成功转化.同年, Joersbo等 [11] 将氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)导入甜菜和烟草原生质体中, 发现转化子中目的基因的瞬间表达； 1991 年章力健等 [12] 将GUS基因、 卡那霉素抗性基因和NPTII基因导入到烟草叶片小块, 得到转化小苗, 转化率达到22.3%； 1997年, Trick等 [13] 将超声处理技术与农杆菌介导转化法相结合, 建立了超声波辅助农杆菌遗传转化方法(SAAT), 他们用此法将GUS基因导入大豆和豇豆组织中, 发现GUS基因的平均短暂表达频率提高100~140倍； 同年王景雪等 [14] 报道利用超声波辅助花粉介导法获得转基因玉米植株, 转化率高达42.9%, 这是关于超声波辅助花粉介导遗传转化玉米并得到可育转化后代的首例报道； 2002年, 陈定虎 [15] 报道将携带PAP基因的植物转化载体导入玉米材料中, 获得1个转化事件； 解志红 [16] 将几丁质酶基因转化棉花远缘杂交高代材料,转化率达到32%； 随后采用超声波辅助植物转化方法在谷子 [17] 、 油菜 [18] 、 花生 [19] 、 高粱 [20] 、 野 [21] 、 黄花梨 [22]等植物上也有转化成功的报道.
超声波辅助植物转化方法虽有操作简单、 周期较短、 克服了植物转化过程中的基因型依赖性等优点, 但其较为突出的缺陷是不同植物、 不同品种、 不同的外植体都要求不同的超声波处理强度、 处理时间和间歇时间, 具体实验要各自寻找最佳超声波处理参数的组合,所以显得较繁琐, 不能一劳永逸, 加之目前所能使用的超声波发生仪及探头的质量不过关, 易破损, 给实验操作带来不必要的困扰.另外超声波处理易导致受体材料的机械损伤和热损伤, 转化效率较低.
为提高转化效率, 进一步简化操作流程, 有必要对前人的研究工作进行总结, 以便发现和解决转化方法还存在的理论和技术问题, 为国内大规模开展转基因研究提供技术储备.
本研究就超声波辅助的植物转化方法的研究进展情况予以综述, 希望能为相关领域的研究工作提供一些有价值的参考资料.
1 超声波辅助植物转化方法的原理及验证
超声波辅助植物转化的原理, 关于超声波辅助植物转化的原理, 众说纷纭, 目前还没有一个肯定而确切的定论.不过, 大多数说法都围绕Rayleigh的超声波能产生空化效应的理论, 认为空化效应是超声波能够辅助植物转化的根本原因.在此基础上, 形成了目前较有说服力的2个假设： （1） 1980年, Zimmermann等 [23]提出, 假设细胞膜的实际膜厚度是由膜两侧的电压和所施加的压力决定的, 膜被挤压的程度取决于其的介电常数和抗压强度等, 并预测存在着一个可以引起细胞膜机械损伤的膜电位差, 而且这个理论预期值的临界压力取决于假设了膜的弹性模量的压力依赖性和固有膜电位, 这就是著名的Zimmermann电场机制模型；1991年, Joersbo等 [11] 根据这个模型提出了使用温和的超声波辅助对植物原生质体进行转化的新方法, 认为在超声波作用下, 细胞膜内的流体静压力引发细胞膜的可逆性破裂, 从而引发细胞与周围介质的物质交换. （2） 1997年, 丁志山和沃兴德 [24] 根据超声波的生物学效用是由空化现象产生的, 提出超声波处理时产生的空化泡在破裂时会释放出瞬时的高压与高温, 这种高温高压所形成的冲击波可能会导致细胞质膜的局部破裂, 使得细胞周围的物质如外源DNA能够进入细胞内, 引发细胞被转化.这2种假设的共同点是都用超声波处理, 引起细胞膜损伤而形成物质的跨膜交换, 不同点是细胞膜损伤的机理不同, 前者认为细胞破裂是由于超声波处理下, 膜内流体静压力发生改变所致, 后者认为是由于超声波所产生的冲击波直接损伤细胞膜.在某一转化事件中, 也可能这种原理都起一定作用.
实验验证： 路德明等 [25] 用超声波处理盐藻, 发现超声波强度大小是盐藻细胞能否破碎的主因, 一定时间范围内随着作用时间的增加, 盐藻破碎率呈直线上升,最高破碎率可达80%, 此后再延长工作时间, 盐藻破碎率变化不大； Gambihler等 [26] 用超声波处理 ‘L1210白血病细胞’ 时发现, 超声波处理既可减少细胞膜原有厚度, 又可使细胞膜的通透性增加, 这样有益于将外源DNA导入细胞； Tachibana等 [27] 用0.3 W/cm 2 、 48 kHz超声波强度处理 ‘HL-60细胞’ 的悬浮液, 发现低强度的超声波就能使细胞膜的脂质双分子层结构发生变化,细胞膜的通透性也因而增强, 结果便是Ara-C更容易进入 ‘HL-60细胞’ , 细胞毒性因而得到加强； Parvizi等 [28]在用超声波处理大鼠软骨细胞蛋白聚糖合成时发现,超声波的空化作用增加了软骨细胞的通透性, 加速了钙离子内流； 卢群等 [29] 用超声波处理酵母细胞, 发现当超声波参数为300 W的功率, 工作时间3 s, 间隔时间为4 s, 工作30次时, 透射电镜观察的结果是, 细胞膜有不同程度的损伤, 并且形成可逆小孔, 即 “穿孔效应” , 并认为这是细胞膜通透性提高的主要原因.当超声波参数增加为功率为500 W, 总作用时间为225 s,脉冲时间为3 s时, 膜的损伤也严重一些, 但细胞并没有死亡, 一定时间的自我修复后细胞又会恢复正常； 姚咏嫦 [30] 更巧妙地选择能生产1,6-二磷酸果糖(FDP)的酵母细胞作为研究对象, 用超声波处理酵母细胞后, 根据细胞的生存能力和介质中FDP浓度的变化, 间接证明膜通透性的改变, 用400、 500、 600 W功率的超声波分别进行处理, 结果发现： 600 W的超声波功率处理时, 随着时间延长介质中FDP的渗出浓度逐渐提高,在处理间隙时间为4 s时, 3种处理均使介质中FDP浓度增加, 但当间隙时间增大到6、 8、 10 s时, FDP的浓度不增反降, 再延长间隙时间为12 s时, FDP的浓度又开始上升, 同时还注意到, 同样的处理, 介质中核酸、 蛋白质浓度的变化不如FDP那么大, 分析可能是因为FDP分子比较小, 更容易穿透细胞膜所致.
上述研究根据细胞颜色的变化、 显微镜或电子显微镜观察、 细胞毒性分析等, 取得了充分可信的证据证明超声波处理可以增加细胞膜的通透性, 为超声波辅助植物转基因研究提供了科学依据.目前, 有关超声波辅助植物转化的方法有2种, 一是超声波辅助其他植物转化方法的转化方法, 如超声波辅助农杆菌介导法、 超声波辅助花粉介导法等, 它们以通常的转化方法为主, 辅助于超声波处理用来提高该方法的转化效率等； 二是超声波处理直接导入法, 即直接将外源基因的DN段用超声波处理方式导入到受体组织或细胞中, 不需要农杆菌介导等技术手段.
2 超声波处理的受体类型
作为超声波处理的受体材料也是超声波辅助转化方法研究的主要内容之一, 因为植物组织、 器官或者细胞的生理年龄、 基因型等与转化效率有关, 筛选易于得到、 方便操作、 适于转化的材料作为处理对象是为了获得转化材料和提高转化效率的有效手段.据不完全统计, 用作受体接受超声波处理的植物材料有叶片、 子叶、 子叶节、 茎段 （包括茎尖） 、 愈伤组织、 百合鳞片、 胚轴、 细胞 （包括原生质体、 花粉、 单细胞植物等） 、 胚 （包括幼胚和成熟胚） 、 幼根、 上表皮细胞等.不同植物品种的同一材料 （如大豆叶片和烟草叶片） 、 同一植物品种的不同材料 （如子叶、 胚、 茎段等） , 超声波的处理强度、 处理时间都不尽相同, 选择合适的超声波处理参数是超声波辅助植物转化研究的重要任务.因为后文在介绍研究进展时要涉及这方面的具体内容, 故就不加详述.
3 超声波处理对外源DNA的影响
外源DNA的完整性也是关系到转化成败的关键因素之一.超声波处理时所产生的强大外力直接或间接地导致外源DNA分子断裂, 这样即使转化成功, 目的基因因断裂而达不到转化初始目的.因此在有关超声波辅助的转化研究中, 必须选择合适的超声波强度和处理时间, 以保证外源DNA分子的完整性 [31-32] .
张宏等 [31] 在超声波介导玉米愈伤组织转化时发现, 超声波处理40 m, 不同声强对DNA产生的效果不同, 声强为0.5 W/cm 2 时, 外源DNA完好无损, 声强上升为0.75 W/cm 2 时, 还能看到明显的主带, 当声强达到1.0W/cm 2 时, 外源DNA严重断裂, 主带消失； Wyber等 [33]研究发现, 超声波处理不会改变质粒DNA的状态, 如超螺旋、 线性和开环等； 赵婷婷等 [34] 以声强400 W的超声波处理鲑鱼精DNA, 处理时长分别为20、 25、 30 m,结果发现, 处理20 m时, 鲑鱼精DNA的条带大小集中于100~250 bp, 随着处理时间延长, 发现鲑鱼精DNA被打断, 电泳条带逐渐变宽； 丛郁等 [35] 在应用超声波直接转化法把rolC基因导入八棱海棠的过程中发现, 超声波功率100 W时, 质粒DNA在30 m之内均能保持完整, 而处理40 m后发生降解； Karshafian 等 [36] 采用超声波介导辅助动物细胞 ‘HTC’ 的基因转化, 他发现在超声波处理下, 分子量为10 kD~2 MD的大分子均可以导入受体细胞, 这是首次报道外源DNA大小与转化的关系； 张莹等 [37] 报道说, 最大功率的超声波处理 （未报道功率数字） 质粒DNA时, 处理5 m, 质粒DNA完好无损, 处理15~20 m, 质粒DNA略有降解, 处理30 m时, 质粒DNA完全降解； 董莲华等 [38] 用功率300 W、 频率24 kHz的超声波处理质粒DNA, 可将质粒DNA降解为200~500 bp的小片段.
4 超声波辅助转化方法的研究进展
1990—1994年, 许宁等 [10] 根据超声波的作用原理,提出 “超声诱导基因转移” 方法, 并在小麦幼胚和动物细胞上成功转化.由于其操作简单、 转化效率高、 不受植物基因型限制等优点, 得到大家认可, 截至目前, 国内外有关超声波辅助或超声波直接介导植物转化的研究已有不少报道.
4.1 超声波介导的直接转化法研究进展
1990 年, 许宁等 [10] 利用超声波介导法将 GUS 基因、 NPTII基因导入小麦幼穗诱导的愈伤组织, 用X-Gluc检测GUS活性, 超声波处理的愈伤组材料均显蓝色, 而对照组不显蓝色； 超声波处理转化愈伤组织207块, 其中30%呈蓝色, 愈伤组织压片镜检发现其中显蓝色的面积达70%~80%； 1994年, 许宁等 [39] 在用超声波处理小麦幼胚时发现, 在超声波功率为0.5 W/cm 2 、 处理时间也相同的情况下, 连续型处理比脉冲型处理的转化率低, 当功率为1.0 W/cm 2 、 处理时长还一样, 连续型超声导致幼胚全部死亡, 结论为脉冲型超声更适合于基因转移； 同一年, 许宁等 [40] 将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)导入缺失二氢叶酸还原酶基因的仓鼠细胞(CHO), 外源基因转化率达到2.8×10 -3 , 同时还发现, 脉冲宽度对转化率也有较大影响, 在 ‘CHO细胞’ 导入Calcein的实验中, 当占空比5:1、 作用时间2 m时基因导人率为79%, 而当占空比5:4、 作用时间2 m时导入率则下降到43%； 1990年, Joersbo等 [41] 采用温和超声波处理将氯霉素乙酰转移酶(CAT)导入甜菜和烟草原生质体中, 即在含质粒DNA的介质中用20 kHz超声波处理原生质体, 发现转化子中目的基因的瞬间表达,当瞬间表达在烟草原生质体中达到80%时, 超声波处理对原生质体的活性还没有太大影响, 同时他们还发现, 在30 W、 570 ms脉冲超声波处理下, 随着介质中质粒DNA 浓度的增大(0~110 μg/mL), CAT基因活性也增高(0%~2.0%)； 1991年章力健等 [12] 采用超声波直接导入外源基因法转化烟草, 将GUS基因、 卡那霉素抗性基因和NPTII基因导入到烟草叶片小块, 即在含上述基因的处理介质中用强度为0.5 W/cm 2 的超声波脉冲处理30 m, 经检测, 有86%的叶片小块有GUS短暂表达, 处理叶块在含卡那霉素培养基上再生出小苗, 经分子检测, 得到转化小苗, 转化率达到22.3%, 他认为,超声波处理可以在外植体上产生易于农杆菌进入的通道, 使得农杆菌与外植体间的接触面增大, 所以转化率有所提高； 1995年, 秦松等 [42] 报道用超声波处理饨顶螺旋藻制备原生质体和单细胞, 发现当超声波以20 kHz频率、 15 W功率处理饨顶螺旋藻悬浮液30 s, 可使藻丝体断裂成(15.0&plun;1.6)个细胞长度, 随着作用时间的延长, 藻丝体断成2~6个细胞长度, 此时发现有些细胞的细胞壁结构被破坏, 得到部分原生质体, 再延长作用时间, 可得到少量原生质体和大量单细胞； 1997 年,Wyber等 [33] 将酵母(AH22)细胞等分并悬浮在含有质粒DNA的缓冲液中, 用20 kHz超声波处理缓冲液, 发现当超声波强度为2 W, 处理30 s时, 转化的细胞数量是对照组的20倍, 同时还发现, 在他所使用的超声波强度和时间范围内, 质粒DNA完好无损； 同年, 张宏等 [31]玉米愈伤组织切块, 与质粒DNA一并放入缓冲液中,用声强为0.5~1.0 W/cm 2 的超声波处理缓冲液, 处理时间范围为10~45 m, 结果发现, 处理30 m时转化率达到最高, 为13.3%, 分子检测结果表明, 他们首次成功地将Bt杀虫蛋白基因导入了重要作物玉米中, 并最终得到可育的转基因植株及后代； 1999年, 李重九等 [43] 将烟草叶肉细胞与烟草花叶病毒(TMV)粒子放在缓冲液中, 用超声波处理, 脉冲波强0.5~1.0 W/cm 2 , 处理时间5~30 m, 结果发现, 处理5 m, 再培养48 h, 检测到细胞的转染率为59.7%, 此时TMV粒子在细胞内的增殖也达到高峰, 且这些 TMV 子代有较高的致病力； 2005年, 谢宝贵等 [44] 将银耳菌株Tr21与带有超霉素抗性基因和GUS基因的质粒DNA在超声缓冲液中用超声波处理, 超声波功率设80、 120、 160 W 3个处理, 间隙时间分别分5、 30、 60 s 3个时段, 工作时间分1、 3、 5 m 3个时段, 按正交试验设置, 结果发现, 功率80 W、 间隙60 s、 处理1 m的组合为最佳组合, 得到754.7个转化子, 统计分析证明, 间隙时间和处理时间的长短对银耳芽孢转化率有显著影响, 而声强的影响不大, 超霉素抗性检测得到抗性转化子, 转化子GUS活性检测结果为阳性； 2007年, Song等 [45] 利用低频超声波(40 kHz)处理法, 将质粒pBBR1MCS2导入恶臭假单胞菌(UWC1)、大肠杆菌DH5α和假单胞菌SBW25, 转化率比常规的组 合 转 化 法 高 9 倍 ,比 电 穿 孔 法 高 4 倍 ；Ananthakrishnan等 [46] 用超声波处理不易组培再生的南瓜子叶外植体, 把苄基腺嘌呤导入其外植体组织, 发现非超声波处理的外植体仅再生出很小的苗或芽状结构, 而超声波处理的外植体出苗多、 生长快, 并认为这是超声波处理增加了农杆菌与外植体细胞接触的机会, 从而提高了转化效率.
4.2 超声波辅助植物转基因研究进展
超声波辅助农杆菌介导法： 1997年, Trick等 [13] 将超声处理技术与农杆菌介导转化法相结合, 建立了超声波辅助农杆菌遗传转化方法(SAAT), 他们用此法将GUS基因导入大豆和豇豆组织中, 发现GUS基因的平均短暂表达频率提高100~140倍, 随后他们又用此方法转化大豆胚性悬浮培养物 （直径2~4 mm的胚性团块）[47] , 处理6~8周后发现了转基因克隆, 未用此法转化的同样组织没有得到转基因克隆, 对超霉素抗性苗的分子检测证实T-DNA已整合到胚性组织中； 1999年, Humara等 [48] 利用SAAT法将含有uidA基因的质粒导入叶松的子叶中, 培养7天后, 49.7%的子叶呈现弥散的蓝色, 不过培养30天时, 所有子叶全部死亡, 作者认为这可能与细菌感染后植物的过敏性反应有关； 国内, 2001年, 姚春娜等 [49] 用超声波介导发根农杆菌的转化, 将发根农杆菌菌株A4、 黄瓜子叶和下胚轴切段放入超声波处理缓冲液中, 超声波强度 500 W, 频率50 kHz, 处理时间设为0、 2、 5、 10 s 4个时段.发现处理对子叶和下胚轴的发根诱导频率有明显的促进作用, 对照组发根生成率依次分别为21.1%和2.7%, 而处理组 （超声波处理 2 s） 的根生成率依次为 54.1%和33.4% (P<0.01), 经冠瘿碱检测证明发根合成了农杆碱； 2003年, 赵东利等 [50] 采用超声波处理将发根农杆菌A4等导入苦豆子子叶和下胚轴外植体中, 超声波功率120 W, 频率50 kHz, 处理时间分5、 15、 25、 30 m 4个时间段, 处理外植体继续培养、 诱导生根, 结果发现, 随超声波处理时间的延长子叶和下胚轴的转化率逐渐提高, 25 m时达到最高点 （分别为83.7%和39.1%） , 而对照组的转化率仅有14.4%和9.8%, 处理30 m时, 转化率又明显下降, 下胚轴的转化率由 39.1%下降为30.2%, 子叶的转化率由83.7%下降到60.5%, 说明此时超声波的处理已导致外植体组织受损； 2004年, 姜玲等 [51] 应用SAAT法转化番木瓜胚性愈伤组织, 其他条件相同的情形下, 超声波处理15 s, CP基因G转化系的转化率由对照组的1.6%上升为26.3%, CP基因B转化系的转化率由对照组的0提高到16.7%； 2014年, 薛晓锋等 [52] 采用SAAT法将耐盐基因SeNHX1导入紫苜蓿子叶外植体中, 超声波源自超声波清洗仪, 处理时间为0、 5、 10、 20、 30 m 5个时间段, 处理时间20 m之前,随着处理时间延长, 卡那霉素抗性愈伤存活率也逐渐增加, 但处理时间为30 m时, 存活率反而下降, 转化体DNA进行分子检测证实耐盐基因的存在.
超声波辅助花粉介导法： 关于外源DNA能否进入花粉粒, 最早采用的方法是花粉粒与外源DNA混合培养, 处理花粉授粉后, 有些后代植株表型发生变化 [53-55] ,此间, Hesolp-Harrison [56] 通过试验发现外源DNA能进入水合花粉的内壁, Picton等 [57] 和O’ Driscoll等 [58] 发现萌发的花粉管尖端细胞的细胞壁缺失, 并认为外源DNA可能通过花粉管尖端缺少细胞壁的细胞的胞吞作用进入花粉内, 但这些发现或推论都没有分子学上的依据, 何况Hesolp-Harrison等 [59] 在1988年、 Kranz等 [60] 在1990年还有相反的报道, 所以Langridge等 [61] 认为, 通过花粉途径进行谷物类植物的转化是很难的, 上述一些研究成果大概有人为之嫌； 接着研究者又试图用一些其他方法解决外源基因导入花粉粒问题, 如,Matthews等 [62] 通过电激法将外源基因导入烟草, 注射法、 基因法等也成功将外源DNA导入花粉粒, 这些研究结果经分子杂交实验、 GUS活性分析、 电镜观察等手段均得到花粉被转化的依据； 但是证明外源DNA能够进入花粉且能够保证花粉具有一定的生活力的研究还不够, 对这些携带外源基因的花粉的育性大小还需要详细探讨 [63] ； 1996年, Deng等 [64] 在总结以前的有关转化花粉的研究时首次提出花粉介导法这个概念,就在1997年, 王景雪等 [65] 报道利用超声波辅助花粉介导法获得转基因玉米植株, 转化率高达42.9%, 这是关于超声波辅助花粉介导遗传转化玉米并得到可育转化后代的首例报道； 2004年, 王景雪等 [14] 进一步介绍该转化材料中目的基因能够稳定遗传和表达, 获得了转基因纯合株系, 并认为采用这种转化方法, 避免了传统的基因法和农杆菌介导法转化所要求冗长的组织培养过程, 转化方法简单, 易操作, 具有很强的实用性； 2002年, 陈定虎 [15] 报道采用超声波辅助花粉介导法将携带PAP基因的植物转化载体导入玉米材料中, 获得1个转化事件, 抗病鉴定结果为接种病毒后对照7天发病,转化系25天时也未发病； 解志红 [16] 采用超声波辅助花粉介导法将几丁质酶基因转化棉花远缘杂交高代材料, 转化率达到32%； 2004年, 王节之等 [17] 采用超声波辅助花粉介导法将几丁质酶基因导入谷子品种 ‘晋谷21号’ 不育系, T 1 代得到PCR检测阳性植株, T 2 代喷雾除草剂筛选, 存活植株做抗病鉴定, 结果转化系抗病性明显高于对照, 获得了双抗植株； 杜春芳等 [18] 利用超声波辅助花粉介导法将GUS基因导入油菜’ 晋油7号’ ,获得6个转化植株； 2006年, 梁雪莲等 [19] 利用花粉介导法将抗虫基因CpTI导入花生品种 ‘仲恺01号’ , 并发现超声波强度为100 W时, 花粉无损伤, 200 W时, 细胞结构完整, 但细胞壁受损, 300 W时, 花粉解体, 同时还发现超声波强度为200 W时, 染色观察结果显示花粉仍具有生活力； 2007年, Wang等 [20] 以超声波辅助花粉介导方法把带有 GUS 基因和 NPTII 基因的质粒DNA导入高粱雄性不育系 ‘A 2 V4A’ , 获得了转基因后代材料； 2008年, Wang等 [65] 将抗草甘膦基因aroA-M1用超声波辅助花粉介导法转入油菜品种, 获得了抗草甘膦除草剂的转基因植株； 杜建中等 [66] 以超声波辅助花粉介导法将水稻几丁质酶基因导入玉米自交系 ‘海92-1’ 中, 获得了5株转基因植株, 对其后代株系进行抗病鉴定, 结果发现转基因株系植株的抗病性比非转化对照株系提高1~2级； 2009年, 魏玉杰等 [21] 以超声波辅助花粉介导法将萝卜抗菌肽基因转入野花粉并给野授粉, 结实率高达80%, 超声波处理时间对授粉后结实率的影响达显著水平； 2010年, 任小燕等 [67] 采用超声波辅助花粉介导法把山菠菜胆碱单加氧酶基因(AhCMO)导入玉米自交系 ‘郑58’ 中, 测定生理指标的结果证明转化植株的耐盐性比对照提高1~3级； 2011年, 韩凯 [68] 采用超声波辅助花粉介导法将EPSPS基因和谷氨酰胺合成酶基因(GSI)导入玉米 ‘玉美头’ 品种中, 获得了转化植株, 转化率仅为4.17%, 但仍高于基因法的转化率； 林春晶等 [69] 利用超声波辅助花粉介导法 （有改良） 将玉米植酸酶基因phy转入玉米品种,经PCR和RT-PCR检测, 证明得到转化植株, 目的基因也得到转录表达； 2012年, 宋鉴达等 [70] 利用经过改良的超声波辅助花粉介导法将植酸酶基因phy和bar基因转化到玉米品种 ‘郑单958’ 中, 经分子检测, 获得了转化阳性植株； 2013年, 马倩倩等 [22] 以黄花梨花粉为载体, 将绿色荧光蛋白基因GFP导入黄花梨植株, 获得了转化植株, 转化率为3%, 这在果木转化中也算是较高的转化效率； 同年, 李娜等 [71] 把绿色荧光蛋白基因GFP转入玉米离体花粉中, 对转化花粉进行体外培养和人工授粉, 用荧光显微镜观察GFP基因在花粉、 花粉管以及胚中的表现, 发现转化胚与非转化胚均有强烈荧光, 认为以花粉粒荧光反应作为花粉转化依据不可靠； 同时还发现, 转化花粉人工授粉后, 被授粉植株的花粉管和胚中均有GFP表达的荧光反应, 认为后两者可作为花粉介导转化的证据, 授粉植株的种子播种后得到转化植株及后代.2014年, 王小丽等 [72] 采用超声波辅助花粉介导法首次将BADH基因导入 ‘郑58’玉米自交系, 获得了耐盐的转基因转化材料.
除上述超声波辅助农杆菌介导法、 超声波辅助花粉介导法外, 就作者本人目前掌握的资料还没有发现超声波辅助其他遗传转化方法的研究.就狄红梅 《超声波处理对大白菜花粉管通道法转基因的影响》[73] 一文经作者甄别也应属于超声波辅助花粉介导法, 严格意义上讲其采用方法与超声波辅助花粉介导法更相近.
5 超声波辅助植物转化方法的优点
超声波辅助的遗传转化方法的优点包括： 不需要贵重精密仪器设备, 所以投资少； 方法简单易于操作；组培过程简单或不需组培过程, 省时省力； 出现嵌合体的概率低或没有； 突破基因型屏障, 适用范围广, 单子叶植物也广泛应用； 转化效率高、 转化工作效率也高.
1996, 王国英等 [74] 用基因法、 超声波法等转化玉米, 转化玉米幼胚或胚性愈伤组织, 基因法两种外植体均转化成功, 但转化率低, 最高转化率为平均每皿0.58个转化体 （每皿50~60个幼胚或胚性愈伤） , 超声波处理直接转化方法转化率最高为15.3% (0.5 W/cm 2 ,30 m), 超声波处理提高转化效率的效果明显； 2002年,梁雪莲等 [75] 采用注射法、 花粉介导法和萌动胚法转化bar基因导入玉米 ‘黄糯’ 、 ‘白糯’ 、 ‘金黄96C’ 等中, 均获得了转化植株, 但3种转化方法结实率分别为1%、3%~4%、 3%~4%, 从转化目的性看, 后两者也强于注射法, 进一步分析发现, 同种试验条件下, 这3种方法的转化率高于基因法和农杆菌介导法, 且不需组培和再生过程, 省时省力； 2011年, 韩凯 [68] 采用超声波辅助花粉介导法将 EPSPS 基因和谷氨酰胺合成酶基因(GSI)导入玉米 ‘玉美头’ 品种中, 获得了转化植株, 转化率仅为4.17%, 但仍高于基因法的转化率.
6 展望
6.1 存在问题和应对策略
超声波介导的植物转化方法除了上述的优缺点,还存在的问题包括： （1） 导入的外源基因通过非同源重组形式整合, 随机性较大, 可能导致导入基因的沉默或者插入位点原功能基因的失活.这一问题可通过重组位点介导定点整合技术或者定点酶切介导定点整合技术来解决, 即将外源DNA构建到Cre-lox等重组整合系统[76] ,然后转化, 也可结合锌指酶介导的定点整合技术 [77] 来完成转化； （2） 超声波辅助介导对受体材料所产生的机械损伤和热损伤, 1998年, Santarem等 [78] 用扫描隧道显微镜观察超声波辅助处理的大豆子叶, 发现子叶表面和深层有许多的微伤口； 章力健等 [12] 、 邱树毅等 [79] 分别观察到超声波在介质中传播时, 会使介质的温度升高, 升高17~25℃, 温度升高也会造成外植体损伤.其解决方案一是优化超声波处理强度, 尽量降低机械损伤, 二是配备冰浴系统, 使整个超声波处理过程处于低温状态, 减少高温损伤； （3） 针对不同的受体材料, 都需要摸索不同的超声波处理强度和处理时长, 工作繁琐, 且重复性差.解决问题的关键是开发植物转化专用的超声波处理设备, 这个设备除操作简单外, 其超声波强度范围应适当加宽, 探头强度要更硬, 处理室应可放置一定体积的冰浴盒, 这样便于优化处理强度和处理时长的组合, 并且无需购买多台设备以备用； （4） 转化效率有待提高, 通过仪器配制的改进、 处理介质的优化、 处理参数等的完善, 可以提高超声波介导的植物转化方法的转化效率.
6.2 未来发展趋势
植物转基因研究已有30年历史, 中国的转基因研究也正在步入转基因作物产业化的起步阶段, 随着时展和社会进步, 植物转基因研究将呈现一个欣欣向荣、 成果斐然的新时代, 因而完善现有植物转化方法, 开发新的转化方法是历史赋予人们的使命.
随着人们对超声波物理、 化学性质的进一步了解和掌握, 超声波介导的植物转化方法的操作过程和步骤将不断简化, 转化效率得到提高, 加之其又可克服转化过程中基因型的依赖性和便于推广应用, 故其应用前景十分广阔.
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