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2019年北京市鱼类致病菌对抗菌药物的感受性监测分析
2016年8月,河北省涞源县一家鲟鱼养殖场突发疾病,且出现大量死亡.为确定病原,从具有典型症状的患病鱼的肝、肾和脾中进行病原菌分离鉴定.经28℃培养后,上述三个组织中均分离获得大量形态一致菌落.肝、肾和脾分离的病原菌分别编号为LY160816L、LY160816K、LY160816S,经形态特征、生理生化鉴定以及16S rDNA基因序列比对,鉴定结果为海豚链球菌.结合临床症状,综合判断,导致该场鲟鱼暴发性死亡的病因是感染了海豚链球菌.
文/ 贾丽 王小亮 王静波 徐立蒲 曹欢 王姝 张文
为落实全国水产技术推广总站联合我站实施的“主要水产养殖动物病原微生物耐药性普查”项目.我站于2016年4月～10月,分别在北京市金鱼和虹鳟鱼主养殖区选择示范点,对其患病鱼定期进行分离病原菌,并测定其对水产用抗菌素类药物的敏感性.具体分析情况如下.
一、材料和方法
1.供试药物
选用我国现在允许使用的水产用抗菌类药物.氨苄西林钠、红霉素、新霉素、盐酸土霉素、多西环素、氟苯尼考、甲砜霉素、盐酸诺氟沙星、诺氟沙星、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、新诺明.
2.供试菌株
2016年4月～2016年10月,从北京市通州区3家金鱼养殖场和怀柔区2家虹鳟鱼养殖场病鱼体内,分离病原菌.从金鱼体内分离气单胞菌38株,其中嗜水气单胞菌11株、温和气单胞菌27株.从虹鳟鱼体内为分离出气单胞菌.具体的菌株详细信息见附录1.
3.供试菌株最小抑菌浓度的测定
采用MIC常规测定方法.
4.数据统计方法
为便于数据分析,我们界定了浓度梯度稀释法检测值的耐药线.新霉素、红霉素、盐酸诺氟沙星、诺氟沙星、多西环素、氟苯尼考设定为≥12.5g/mL,氨苄西林钠、盐酸土霉素、甲砜霉素设定为≥25g/mL,磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶钠、磺胺间甲氧嘧啶钠、新诺明设定为≥500g/mL.加权平均MIC（WMMIC）等于∑（菌株数×对应的MIC值）/菌株总数,MIC90值采用SPSS统计.
二、结果
1.养殖场病害、药物使用和损失情况
在监测期间, 金鱼发生的主要病害种类有车轮虫病、烂鳃病、掉眼病和金鱼造血器官坏死病,其中烂鳃病主要集中在6月至8月,车轮虫病和掉眼病在监测期间每月均有发生,掉眼病的年病死率约5%～10%.金鱼造血器官坏死病发生在6月和7月,造成的死亡率约30%.养殖场采用的药物种类有车轮净、聚维酮碘、溴碘、戊二醛、二氧化氯、三黄粉、中草药和恩诺沙星粉.
虹鳟鱼发生的主要病害种类有传染性造血器官坏死病、水霉病、细菌性烂鳃病,其中传染性造血器官坏死病造成的经济损失最为严重,苗种死亡率达80%以上,烂鳃病主要发生在6月龄以上鱼种,造成的死亡率约5%.养殖场采用的药物种类和总用量如下：聚维酮碘、盐酸土霉素、氟苯尼考、盐酸恩诺沙星、三黄粉等.
2.北京市金鱼源气单胞菌耐药性总体情况
总体上,北京市金鱼源气单胞菌100%耐受氨苄西林钠,其次对磺胺类药物耐药率最高,均在94%以上,耐药浓度在500g/mL以上；对新霉素和盐酸土霉素,耐药率在23%~32%之间.耐药率低于10%的药物种类为红霉素、盐酸诺氟沙星、诺氟沙星、多西环素、氟苯尼考和甲砜霉素,耐药率分别为7.89%、0%、0%、2.63%、0%和0%.详见表1.
3.不同种类病原菌的抗菌药物耐药性
2016年监测分离出嗜水气单胞菌11株、温和气单胞菌27株.按菌株种类统计其对所检测药物的耐药率和加权平均MIC值,结果见表2.从表上可以看出两种气单胞菌对氨苄西林钠、盐酸诺氟沙星、诺氟沙星、氟苯尼考、甲砜霉素、新诺明和磺胺间甲氧嘧啶钠的耐药率完全相同,或100%耐药或100%敏感；其加权平均MIC值在100%耐药种类上相同,而在100%敏感种类上不同.两种菌对新霉素、红霉素、磺胺二甲氧嘧啶钠和磺胺嘧啶钠的耐药率差异在7%以下,加权平均MIC值前两者有所差异,后两者差异在5%以下.两种菌对多西环素和盐酸土霉素的耐药率差异在9.09%～19.2%,加权平均MIC值多西环素上有较大差异,而在盐酸土霉素上差异在5%以下.耐药率差异直观图见图1.
（1）嗜水气单胞菌对抗菌药物的感受性
检测了11株嗜水气单胞菌对各抗菌药物的感受性,分布情况见表3.从表上可看出,嗜水气单胞菌对新霉素的MIC集中在3.13g/mL～25g/mL,对红霉素的MIC主要集中在3.13g/mL～6.25g/mL,对盐酸诺氟沙星和诺氟沙星的MIC主要集中在1.56g/mL～3.13g/mL,对多西环素的MIC主要集中在0.39g/mL～0.78g/mL和3.13g/mL～6.25g/mL两个区间,对盐酸土霉素的MIC主要集中在6.25g/mL～25g/mL,对氟苯尼考的MIC主要集中在0.39g/mL～1.56g/mL,对甲砜霉素的MIC主要集中在0.78g/mL～3.13g/mL,对氨苄西林钠和磺胺类药物的耐药浓度几乎均在最高测试浓度上限.
（2）温和气单胞菌对抗菌药物的感受性
检测了27株温和气单胞菌对抗菌药物的感受性,分布情况见表4.从表上可看出,温和气单胞菌对新霉素的MIC集中在3.13g/mL～12.5g/mL,对红霉素的MIC主要集中在3.13g/mL～6.25g/mL,对盐酸诺氟沙星、诺氟沙星、盐酸多西环素的MIC从≤0.2g/mL到6.25g/mL均有分布,对盐酸土霉素的MIC主要集中在6.25g/mL～25g/mL,对氟苯尼考的MIC主要集中在0.39g/mL～1.56g/mL,对甲砜霉素的MIC主要集中在0.78g/mL～1.56g/mL,对氨苄西林钠和磺胺类药物的耐药浓度几乎均在最高测试浓度上限.
4.病原菌对抗菌药物感受性的年度变化
针对金鱼源气单胞菌对抗菌药物的加权平均MIC值和耐药率,按年份进行统计,统计结果见表5.从表上可以看出,气单胞菌对新霉素的加权平均MIC值和耐药率大幅上升,这可能与不同年份采用新霉素或其硫酸盐不同有关；对盐酸诺氟沙星的MIC值有小幅上升,但都在耐药线之下,这可能与养殖场2016年使用了同类药物恩诺沙星制剂有关；对多西环素、氟苯尼考和甲砜霉素的加权平均MIC值和耐药率都呈现下降趋势,调查显示2016年该养殖场未使用过这三种药物,耐药率和耐药浓度下降可能与菌株耐药性的自然消失有关.
三、分析与建议
上述数据表明：①气单胞菌对氨苄西林钠呈现100%耐药,耐受浓度高于100g/mL.有关资料表明该菌对青霉素类药物天然耐药,而氨苄西林属于半合成青霉素类药物,理论上解释了本文中该菌对氨苄西林钠耐药结果,同时意味着今后进行耐药普查时,无需检测气单胞菌对青霉素类药物的感受性.②气单胞菌对磺胺类药物呈现较高的耐受率,均在90%以上.磺胺类药物在北京地区水产养殖上已使用约30年,可能是导致气单胞菌呈现高耐药率的主要原因.但是,检测中发现磺胺类药物高浓度管的浑浊度低于低浓度的浑浊度,资料显示磺胺类药物是抑菌药,因此,目前采用浓度梯度稀释法检测磺胺类药物的感受性是否合适有待商榷.③金鱼源气单胞菌总体上对盐酸诺氟沙星、诺氟沙星、氟苯尼考和甲砜霉素100%不耐药,对多西环素的耐药率也低于5%.因此,当养殖场发生细菌性疾病时,可优选同属氟喹诺酮类的嗯诺沙星或者多西环素.而氟苯尼考和甲砜霉素在使用过程中,容易使病原菌短时间产生较高的耐药性,同时这两种药物属于剂量依赖型药物,因此,应慎用,如需使用,需要一次给足剂量,并延长该药物的使用间隔时间.④往年监测中发现不同养殖场、不同鱼类、不同病原菌种类、甚至同种病原菌的不同菌株对抗菌药物的感受性不同.然而,对生产方式和用药方式相同的2家～3家金鱼养殖场连续2年监测表明,嗜水气单胞菌和温和气单胞菌对药物感受性,总体上呈现相似的特征,如对红霉素、氟苯尼考和甲砜霉素等敏感区间相同.对盐酸诺氟沙星、诺氟沙星、多西环素等敏感区间相似,对氨苄西林钠和磺胺类药物均呈现高耐药性.这些特征提示我们继续进行耐药普查时,可减少梯度范围.同时,可依据这个特性,分区域进行病原菌耐药普查,以避免监测时分离不到目标病原菌的情况.
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