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金樱子总黄酮提取工艺和生物活性
莫奉喜1,2 董伟1*
（1. 湖南农业大学动物医学院,长沙410128；2. 湖南正大畜禽有限公司,长沙410600）
摘 要：金樱子具有药食同源的特点,在我国中药方剂以及食品工业中应用较多,其所含的黄酮类成分近年来备受关注.根据已有的文献报道,本文综述了金樱子总黄酮的提取以及生物活性等内容,为金樱子总黄酮的进一步研究与利用提供科学依据.
关键词：金樱子；总黄酮；提取；生物活性
中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1008-6137（2016）05-0023-04
0 引言
金樱子为蔷薇科植物,其果实味甘,有糖罐等多种别称,果实成熟时呈深黄至酒红色.我国金樱子资源丰富,多见于溪流、山岭灌木丛等处,广泛分布于湖南、云南等地区.金樱子既可作为药物,也可为食品.中医常将金樱子或由其组成的方剂,如加减金锁固精汤、金樱膏、无价保真丸等,用于遗精遗尿、虚损之症的治疗.同时,也可将其生产为金樱子酸奶[1]、金樱子饮料[2]等食品.而且,总黄酮是大多数草本中富含的一类有效成分,具有抗癌、调节血糖血脂、抗氧化、抗炎等生物活性.近年来,研究发樱子中总黄酮的含量较高,受到了许多研究人员的青睐,主要有槲皮素、山奈酚、异鼠李素、芹菜素等组分[3-4].关于金樱子总黄酮提取以及生物活性等研究文献也开始越来越多.本文就金樱子总黄酮的提取与生物活性等内容进行了综述,以供参考.
1 提取工艺与纯化
目前优化金樱子总黄酮提取工艺的设计方法主要有单因素设计、正交设计、均匀设计以及响应面设计等,提取方法有传统回流提取、超声波辅助提取、微波辅助提取、酶辅助提取、半仿生提取等.
1.1 传统回流提取法
传统回流提取法主要依托高温破坏细胞壁,释放植物内的黄酮成分.刘军海等人[5]通过单因素设计获取对金樱子总黄酮得率影响较大的4个因素,并在该4个因素的基础上建立了响应面试验,拟合数学模型,得到理论预测的最佳条件与得率,随后在预测条件修正后进行了验证,最终确定该优化条件下1次提取金樱子总黄酮的得率为7.16%.安冬琴等人[6]经过响应面优化液料比、乙醇浓度以及时间等金樱子总黄酮提取条件后,将优化后的条件进行修正,得到其提取率为8.13%,与优化的预测值结果十分接近,并获得最佳工艺为液料比1∶30、乙醇浓度65%以及时间1.5h.
刘焱等人[7]研究了提取温度等因素对金樱子总黄酮提取率的影响,在正交试验设计优化后确定最佳工艺为温度70℃、时间60min、3次、乙醇浓度60%、料液比1∶20,其中影响最大的因素为乙醇浓度,但该法的得率较于其他方法的得率较低,仅为0.498%.然而邓亚男等人[8]利用传统的回流提取金樱子总黄酮,其提取率为4.855%,远高于刘焱等人[7]的结果,推测其原因与金樱子的采摘期、生长环境、生长地域、样品预处理、总黄酮测定方法等有关.
对传统的回流法的影响因素优化后提取金樱子植株的根、茎中总黄酮可使其含量分别达到11.83%、9.21%[9].可见金樱子除了果实外,其他部位的药用价值也较高.
1.2 超声波辅助提取法
超声波具有空化效果,联同震动作用,在一定温度下破坏细胞壁,再在震动的作用下可促进植物成分释放到溶剂中.刘焱等[10]人通过正交设计考察了超声波辅助提取过程中涉及的超声功率、时间与温度等因素对金樱子总黄酮提取率的影响,获得了优化后的提取率为0.632%；卢俊等人[11]采用超声波辅助提取获得最高的提取率为15.28%.二者的提取率差异较大.植物金樱子除了其果实富含总黄酮,从其叶中提取总黄酮也有报道.陈英文等人[12]经正交试验设计获得超声波辅助提取金樱叶中总黄酮的最佳工艺,即液料比40∶1、乙醇浓度50%、超声频率28KHz、超声功率90W、提取时间60min,得率为11.64%.
1.3 微波辅助提取法
微波的升温速度快,穿透力强,细胞破壁的效果较好.微波辅助提取金樱子总黄酮相较于传统加热提取法具有耗时短、得率高的优势.基于单因素设计与正交设计,优化传统提取方法的最佳工艺为10倍溶剂、乙醇浓度75%、提取2次、每次70min,微波辅助提取的最佳条件为10倍溶剂、乙醇浓度65%、提取3次、每次6min,且微波辅助提取的金樱子总黄酮的得率较传统方法高出了15.56%[13].
1.4 酶辅助提取法
酶法辅助提取主要是由于相应的酶可以水解细胞壁中的成分,破坏细胞壁,达到提取的效果.该方法提取条件温和,综合考虑酶的活性,提取温度一般较低.林宣贤[14]考察了单酶与复合酶辅助提取对金樱子总黄酮的影响,结果表明单酶提取时,纤维素酶作用效果优于果胶酶,该结果可能与金樱子细胞壁中纤维素所占比例高于果胶有关,而纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶与β-葡聚糖酶等组成的复合酶提取效果优于单酶辅提,更加优于传统回流法.此外,陈志刚等人[15]采用纤维素酶辅助提取金樱子总黄酮,其最高得率可达到79.30mg/kg.
1.5 半仿生提取法
半仿生提取是一种较新的方法,主要基于药剂学的视角,模拟药物经过胃肠道,并参与其中的过程,吸收被释放的药物有效成分.该法主要涉及溶剂的pH等因素.赖红芳等人[16]采用半仿生法提取金樱子总黄酮,其最佳条件为：pH分别为2、7.5、8.3,液料比20∶1,温度60℃,时间为20min,得率高达9.67%,显著优于普通的回流加热提取法,可见半仿生法提取效率高,药材的有效成分得到充分的释放.赵惠茹等人[17]分3次进行提取,控制每次提取的pH不同,分别为5、7.5与9,尽管该研究中将总黄酮含量作为金樱子提取的参考指标之一,但也可以为金樱子总黄酮提取工艺的进一步优化提供参考.
1.6 纯化
刘月涛采用乙醇加热的方法提取金樱子提取物,经D101大孔树脂过柱除杂、吸附洗脱,得到纯度为78.45%的金樱子总黄酮[3].李尼曼[18]纯化金樱子总黄酮采用了AB-8型大孔树脂吸附、洗脱,获得纯化后的金樱子总黄酮.
2 生物活性
2.1 抗氧化、抗炎、抗凋亡
金樱子总黄酮可抑制猪油的氧化,清除羟自由基[10].其具有较强的还原能力,可清除超氧阴离子、羟自由基,呈现一定的量效关系[19].金樱子总黄酮除了清除体外以上所提及的常见自由基,如羟自由基、超氧阴离子自由基、二苯代苦味酰基自由基等,还可提高过氧化氢处理的HUVEC细胞的存活率,降低细胞凋亡率,升高细胞中的抗氧化酶活性,如SOD、CAT、GSH-Px,其机制与下调促凋亡蛋白Bax、上调抗凋亡蛋白Bcl-2有关,说明金樱子总黄酮对过氧化氢诱导的HUVEC细胞氧化损伤具有保护作用[20,21].
陈传平等人[22]以水、60%甲醇、60%乙醇与60%丙酮提取金樱子总黄酮,其中尽管60%甲醇与60%乙醇提取的金樱子总黄酮得率高且接近,但抗氧化活性存在较大的差异,且水提总黄酮清除羟自由基效果最好,而60%乙醇提总黄酮清除超氧阴离子自由基及抗猪油氧化的能力最佳,在不同溶剂提取的总黄酮浓度相同的情况下表现出了抗氧化活性的差异性,推测其可能与不同溶剂提取得到的黄酮类物质的组分存在差异有关.
四氯化碳常作为急性肝损伤的模型物质,可诱导肝脏氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡.Zhang等人[23]研究表明,金樱子总黄酮对四氯化碳诱导的肝损伤具有保护作用,主要体现在3个方面,即减轻氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡.金樱子总黄酮抗炎作用机制主要是降低与炎症反应相关的转录因子NF-κB 蛋白和促炎因子TNF-α基因表达.而抗细胞凋亡的机制与抑制Fas/FasL和线粒体途径有关.而且,金樱子总黄酮对脑缺血再灌注损伤的保护作用除了与抗氧化与抗细胞凋亡,也与抗炎症有关,主要是降低NF-κB和TNF-α等炎症因子的表达[24].
此外,金樱子总黄酮的红细胞溶血和脂质过氧化的抑制作用、对扑热息痛诱导急性肝损伤的保护作用显示了良好的抗氧化特性,如显著降低MDA,抗氧化应激诱导的细胞凋亡,并调控细胞凋亡相关通路[3,25].
2.2 抗血栓
全血黏度、血小板聚集情况与血栓的形成密切相关,在一定范围内降低全血黏度及抑制血小板聚集,对抗血栓具有重要意义.急性血瘀模型大鼠给予不同剂量的金樱子总黄酮14d后,3种不同剂量的金樱子总黄酮均可降低大鼠的全血黏度,个别给药组的全血粘度甚至与阳性对照组丹参处理的结果接近；同时3种不同浓度的金樱子总黄酮可降低血小板的聚集,当浓度达到240mg/kg的剂量时,其效果与阳性药物阿司匹林的处理效果相当[26].
学者们[27]通过体内和体外试验探究了金樱子总黄酮抗心血管疾病的作用及可能的机制,体外的细胞试验发樱子总黄酮抗心血管损伤与其抗氧化特性[20,21]密切相关,并能抑制活性氧的产生,抑制Caspase-3和Caspase-9的活性,抑制细胞凋亡[28]；且体内试验发樱子总黄酮可以剂量依赖性地减轻大鼠的血栓、减短大鼠尾部血栓长度.
2.3 调节脂质代谢
长期摄入大量的高脂食物存在高脂血症的风险,有脂肪肝形成的可能.在大鼠饲喂高脂饲料的8周内,同时灌胃给予不同剂量的金樱子总黄酮,可增强肝脏中脂蛋白脂酶、肝脂酶的活性,进而降低血清中的总胆固醇、甘油三酯等脂质的水平[29].口服金樱子总黄酮可抑制脂肪酸的合成,促进脂肪酸发生β氧化等,从而降低血脂血糖,调节肝脏的脂肪蓄积,而且Zhang等人[30]指出金樱子总黄酮降低肝脏中胆固醇的沉积与抑制胆固醇的合成无关,推测是与其他的途径有关.
2.4 抑菌
彭成将进一步纯化的金樱子总黄酮通过杯碟法探究其抑菌效果,试验发樱子总黄酮的抑菌作用存在选择性,对金葡萄菌等的革兰氏阳性菌的抑制效果较强,但对大肠埃希菌等的革兰氏阴性菌的作用无明显效果[31].李尼曼[18]则发樱子总黄酮可以显著地抑制大肠杆菌、巴氏消毒杆菌.
另外,探究金樱子总黄酮的安全性对其开发与利用具有重要的指导意义.90d的口服毒性试验证明,金樱子总黄酮的无明显损害作用水平为500mg/(kg·d),当每日口服的剂量达到1000mg/kg或以上,大鼠部分指标出现一定程度的异常[32].说明金樱子总黄酮相对而言安全性较高,但是其毒性是否存在动物种属差异性,有待进一步研究.
3 小结与展望
近年来,人们对保健的认识不断深入,具有保健功效的植物有效成分越来越受关注.作为药食同源的金樱子的总黄酮含量高,安全性高,可以发挥抗氧化、抗血栓以及调节脂质代谢等生物活性,具备良好的保健功能,推测金樱子总黄酮是一种资源获取简单、经济实惠、保健价值高的饲料添加成分,用于动物养殖行业.但目前的文献报道金樱子总黄酮的生物活性多数建立在细胞系或大鼠、小鼠等模式动物的基础上,在畜禽体内外的安全性试验、药效或药代试验有待进一步探究.为了确保畜禽摄入含金樱子总黄酮的饲料后充分利用黄酮类化合物,制备、筛选合适的添加剂剂型也十分有必要.此外,金樱子总黄酮已报道的生物活性相较于大多数常见植物总黄酮较少,可见其功能性有待进一步研究,例如对畜禽的生产与生长性能、疫苗接种后免疫水平、饲养管理中常见的霉菌中毒与热应激的影响,为其开发为畜禽用多功能的饲料添加剂提供研究基础.
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*通讯作者: 董伟.
收稿日期：2016-08-08
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