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牡丹花黄酮的抗氧化活性
窦勇博
（中华全国供销合作总社济南果品研究院,山东济南250014）
摘 要院牡丹是中国特有的木本名贵花卉,素有“花中之王”的美称.黄酮类化合物广泛存在自然界各类植物中,多以苷类形式存在.本实验分别从DPPH·清除能力、·OH清除能力和还原力等三个方面,研究了牡丹花黄酮的抗氧化活性,结果表明：牡丹花黄酮能够清除DPPH·自由基和·OH自由基,同时也具有一定的还原力,牡丹花黄酮对DPPH·和·OH的半清除浓度（IC50）分别为259.29滋g/mL和1573.53滋g/mL,每克牡丹花黄酮的还原力相当于213.07mg抗坏血酸和993.67mg芦丁的还原力.
关键词院牡丹花；黄酮；抗氧化性
中图分类号院O65文献标志码院A文章编号院1008-1038(2016)04-0023-04
收稿日期院2015-08-16
作者简介院窦勇博,男,研究方向为食品生物科学
牡丹是中国特有的木本名贵花卉,素有“花中之王”的美称.黄酮类化合物广泛存在自然界各类植物中,多以苷类形式存在.黄酮类化合物又称、生物类黄酮、黄碱素、维生素P,泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过三碳原子相互连结而成的一系列化合物,其基本母核为2-色原酮.黄酮常用的提取方法有传统提取法、超声波提取法、微波萃取法和酶解法等[1].
近年来随着对黄酮类化合物的不断研究,许多不同的天然黄酮类化合物化合物被开发出来,加之对其药理作用的深入研究,发现其对机体具有许多的生理活性,包括清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗肿、抗过敏、抗菌、抗炎、抗糖尿病、抑制酶的活性、防止血管舒张等作用.另外,黄酮类化合物在食品医药领域的应用前景也是非常的广阔.由于黄酮类化合物分子中含有酚羟基,可有效清除生物体内的氧自由基,是一种天然的抗氧化剂.如花青素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出,这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上,这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老,也可阻止癌症的发生[2].黄酮类化合物通过调节抗氧化酶系统,增强肿瘤细胞中的抗氧化酶活性,降低细胞内活性氧的浓度,选择性杀伤肿瘤细胞,从而有效抑制肿瘤细胞的快速增殖,因此达到抗癌的作用[3,4].
1材料与设备
1.1材料与试剂
芦丁、乙醇、铁、三氯乙酸、三氯化铁,天津大茂化学试剂厂.氢氧化钠、DPPH,天津富宇精细化工有限公司.抗坏血酸、醋酸镁、草酸、水杨酸、磷酸,天津博迪化工股份有限公司.以上试剂均为分析纯.
1.2仪器与设备
小型植物粉碎机,XFB-400,吉首市中诚制药机械厂；旋转蒸发仪,RE100-Pro,上海人和科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计,UV-1800,岛津国际贸易有限公司；水循环真空泵,SHB-III,北京博远祥德科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱,DHG-9140A,上海精宏实验设备有限公司；数控超声波清洗器,KQ-300DB,北京卓信伟业科技有限公司；电子天平,YP3001N,上海精密科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅,HWoSY21-K,北京市长风仪器仪表有限公司；pH计,PHSJ-5,上海仪电科学仪器股份有限公司.
1.3黄酮类化合物的提取
根据前期试验测出提取黄酮的最佳条件是：乙醇浓度60%、提取温度60℃、提取时间40min、料液比1:30,在此基础上,用超声波浸提法来提取牡丹花中总黄酮.提取流程为：牡丹鲜花→分拣→低温烘干→粉碎→超声波辅助提取→抽滤→真空浓缩→冷冻干燥→粗黄酮提取液.
将低温冷冻的牡丹花50℃低温烘干,粉碎机破碎,精确称取牡丹花粉末1.0g,以70%的乙醇溶液为溶剂,料液比为1:30,超声辅助浸提40min,浸提液经抽滤后,加入相应浓度的乙醇定容于100mL容量瓶中作为提取液[5].
1.4黄酮抗氧化性质的研究
1.4.1清除DPPH·能力的测定
精确称取DPPH标准品20.5mg,以95%乙醇为溶剂并定容至250mL容量瓶中,即配制成浓度为2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液.
精确移取2.0mL（待定）黄酮溶液于10mL试管中,分别加入2.0mL配制好的DPPH·乙醇溶液,摇匀,室温下放置30min,以95%乙醇调零,在517nm处测得吸光度值1.同时,精确移取2.0mL黄酮溶液与2.0mL95%乙醇混合后在517nm处测得吸光度值2,然后精确移取2.0mL配制好的DPPH·乙醇溶液与2.0mL95%乙醇混合后在517nm处测得吸光度值0,牡丹花黄酮对DPPH自由基清除率计算公式如下：
清除率等于1-(1-2)0
其中：0—2.0mLDPPH·乙醇溶液与2.0mL95%乙醇混合后的吸光度；
1—2.0mL黄酮溶液与2.0mLDPPH·乙醇溶液混合后的吸光度；
2—2.0mL黄酮溶液与2.0mL95%乙醇混合后的吸光度.
1.4.2清除·OH能力的测定
依次精确移取1mL0.15mol/LFeSO4、1mL2mmol/L水杨酸溶液、1mL（参照腊梅花）的牡丹花黄酮溶液、1mL6mmol/LH2O2于试管中,最后加入H2O2启动反应.于37℃水浴反应0.5h,以蒸馏水为参比,测定不同浓度黄酮溶液在510nm处的吸光值.以1mL0.15mol/LFeSO4,1mL2mmol/L水杨酸溶液,1mL不同浓度的牡丹花黄酮溶液,1mL蒸馏水作为牡丹花黄酮的样品对照组,牡丹花黄酮对·OH清除率计算公式如下：
清除率等于1-(1-2)0
其中：0—以双蒸水代替黄酮溶液的空白对照液吸光度；
1—加入不同浓度黄酮溶液的吸光度；
2—以双蒸水代替H2O2的样品对照液吸光度.
1.4.3还原力的测定
取待测样品液2.5mL,加入2.5mL磷酸缓冲液（0.2mol/L,pH6.6）及2.5mL1%的铁溶液.50℃水浴反应20min后快速冷却至室温,加入2.5mL10%的三氯乙酸,混匀后3000r/min离心10min；取2.5mL上清液,依次加入2.5mL蒸馏水及0.5mL0.1%的三氯化铁.混合均匀,静置10min后于700nm处测得吸光度值.吸光度值越大,表示还原力越强.
以抗坏血酸浓度与其吸光度作图,求出标准曲线方程；将样品的吸光度代入标准曲线方程,求出相对应的抗坏血酸浓度,最终将样品的还原力表示为1g牡丹黄酮中含Xmg抗坏血酸的还原力.
2结果与分析
超氧阴离子自由基对人体的危害特别大,牡丹花中的黄酮酚羟基能够提供氢质子,使氧化性的超氧阴离子自由基发生还原反应,从而终止自由基链式反应.DPPH·自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基[20],加入牡丹黄酮后,具有清除DPPH·自由基的作用.根据线性回归方程,可分别求出牡丹花黄酮、抗坏血酸和芦丁的半抑制浓度IC50.IC50值即清除率达到50%时所需药物的浓度,IC50值的大小表明了抗氧化剂清除自由基的能力高低,一般情况下IC50值越小,抗氧化剂的清除能力越强[6].目前有关牡丹花黄酮的抗氧化活性的研究相对较少.本实验以抗坏血酸和芦丁为参照,研究了黄酮样品的还原力以及DPPH·和·OH清除活性.
2.1黄酮的DPPH窑清除能力
如图1所示,牡丹花黄酮、抗坏血酸和芦丁对DPPH·的清除活性均随浓度的增大而逐渐增大,量效关系显著.相同浓度条件下,牡丹花黄酮的清除DPPH·能力低于抗坏血酸和芦丁.根据线性拟合方程求出牡丹花黄酮的半清除浓度（IC50）为259.29滋g/mL（见表1）.
2.2黄酮的窑OH清除能力
由图2可知,牡丹花黄酮、抗坏血酸和芦丁对·OH清除活性均随浓度的增大而逐渐增大,量效关系显著.相同浓度条件下,牡丹花黄酮的·OH清除能力比抗坏血酸和芦丁要低些.根据线性拟合方程求出牡丹花黄酮对·OH半清除浓度（IC50）为1573.53滋g/mL（见表2）.
2.3黄酮的还原力
图3显示了黄酮的还原力,由图3知,牡丹花黄酮、抗坏血酸和芦丁的还原力均随浓度的增大而增大,量效关系显著.同浓度条件下,牡丹花黄酮的还原力比抗坏血酸和芦丁要低.经计算,1g牡丹花黄酮的还原力相当于213.07mg抗坏血酸和993.67mg芦丁的还原力（见表3）.
3结论与展望
本文采用生物、物理及化学的原理,研究了菏泽地区栽种的牡丹花黄酮的抗氧化活性.根据最佳提取条件提取牡丹黄酮,然后研究了抗氧化性能的差异.分别采用DPPH·自由基体系、·OH自由基体系和还原力测定体系,对牡丹花黄酮的抗氧化性能进行了测定比较,并用抗坏血酸和芦丁作为对照.实验结果表明：牡丹花黄酮能够清除DPPH·自由基和·OH自由基,同时也具有较强的还原力.牡丹花黄酮的还原力均随浓度的增大而逐渐增大,量效关系显著；相同浓度条件下,牡丹花黄酮的还原力比抗坏血酸和芦丁要低些.
本文中所提取的黄酮为牡丹花中的总黄酮,若能采用柱层析、旋转蒸发仪等方法对粗提物进行分离,采用高效液相色谱、质谱等方法对牡丹黄酮化合物进行结构鉴定,实验结果将更有说服力.关于分子印迹技术[7]在牡丹黄酮领域的应用,研究相对来说比较少,尚处于探索阶段,将其直接应用于黄酮提取的关键问题尚未解决,今后应该加强这方面的基础研究,积累相关的数据,解决大规模提取分离工艺条件和设备方面的问题,促进分子印迹技术的不断发展.随着对分子印迹技术研究的不断深入,其实际应用的问题将得到解决,分子印迹技术将在天然活性产物的开发利用方面发挥其巨大的价值.
参考文献院
[1]程源斌.中原牡丹花黄酮的检测、纯化及抗氧化活性研究[D].郑州:河南科技大学,2011.
[2]谢田伟.枇杷花黄酮与精油的提取及其性质分析研究[D].厦门:集美大学,2012.
[3]ZhouTR.InhibitionofmurinebladdertumorigenesisbysoyIsoflonoidsviaalterationsinthecellcycle,apoptosisandangiogenenesis[J].CancerRes.1998:5231-5238.
[4]朱俊东,杨家驹.大豆异黄酮抗癌作用研究进展[J].国外医学·卫生学分册,1998:257-260.
[5]裴咏萍,李维林,张涵庆.三氯化铝比色法测定中药中总黄酮含量的方法改进[J].现代中药研究与实践,2009,23(4):53-55.
[6]田云.几种植物抗氧化剂制备、评价与应用初步研究[D].长沙:湖南大学,2004.
[7]宋可珂.玫瑰花黄酮提取分离及抗氧化性能研究[D].北京:北京林业大学,2012.
抗氧化论文范文结:
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1、抗感染药学杂志