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近10年贝母类药材鉴定技术进展
李明哲1,韩金秀2
（1.吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118；2.长白县人参产业发展服务中心,吉林白山134000）
摘 要：本文通过查阅近年来相关资料,从性状、显微、分子标记、高效液相等鉴定,概述贝母类药材鉴定技术近年来的研究进展,为今后贝母类药材的鉴定提供参考.
关键词：贝母类药材；鉴定技术；研究进展
中图分类号：R282.5 文献标识码：A DOI 编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.10.028
贝母类药材作为临床上的常用药,其来源复杂,经常出现伪品.本文综述贝母类药材的鉴定方法,对今后的贝母类药材的应用有较高的实践意义.
1 性状鉴定
性状鉴定主要是观察完整的中药及中药饮片.唐生斌等[1]运用性状的不同特征对贝母类药材及它的混淆品、伪品等进行对比研究,得出不同样品的性状具有一定的差异,可以将性状特征的差异作为贝母属种间鉴别的参考依据.
浙贝母：扁圆球形,高10~20 毫米,直径10~35 毫米,二瓣,类肾形,近等大,表面稍粗糙,类白色至淡,内表面淡棕色[1].
湖北贝母：扁圆球形,高6~22 毫米,直径6~35 毫米,二瓣,类肾形,多数大小悬殊,表面稍粗糙（有的可见棕色斑点）,类白色至淡棕色[1].
伊贝母：新疆贝母为类球形略扁,高5~10 毫米,直径6~12毫米,二瓣,月牙形,近等大,紧靠,类白色,表面光滑.伊犁贝母为圆锥形或类球形,高8~12 毫米,直径10~25 毫米,二瓣,心形,近等大,类白色或淡,表面稍粗糙[1].
平贝母：扁球形,高5~10 毫米,直径6~20 毫米,二瓣,大小相近相对抱合,乳白色或淡黄白色,表面光洁[1].
川贝母：松贝为类圆锥形或近球形,高3~8 毫米,直径3~9毫米,二瓣,大小悬殊,呈怀中抱月形,类白色,表面光洁.青贝为类球形或扁球形,高4~14 毫米,直径4~16 毫米,二瓣,大小相近,相对抱合,类白色,表面光洁.炉贝为长圆锥形或略扁斜,高7~25 毫米,直径5~25 毫米,二瓣,大小相近,相对抱合,类白色或浅棕,表面有的具有棕色斑点[1].
2 显微鉴定
显微鉴别是鉴别贝母类药材的重要方法之一,可以通过药材的粉末颜色,淀粉粒大小、形状,层纹形状、有无,脐点位置、形状等多种因素进行区别[2-4].
通过比较可知,浙贝母粉末为淡,湖北贝母、川贝母、伊贝母、平贝母粉末为类白色.浙贝母区别于其他贝母的最大区别是可见草酸钙针晶,川贝母、平贝母、伊贝母粉末均有多脐点单粒和复粒,川贝母中多脐点单粒数目最多,浙贝母中复粒最多.平贝母、浙贝母、伊贝母粉末中的淀粉颗粒边界较光滑,湖北贝母有起伏,而川贝母有短分枝,这可分别作为鉴别湖北贝母和川贝母的一大特征.湖北贝母淀粉粒层纹最为明显,这一特点也成为5 种贝母中湖北贝母的最大鉴别特征.
3 薄层色谱（TCL）鉴定
黄小鸥等[5]采用了氯仿—醋酸乙酯—甲醇—水（40∶40∶15∶10）的下层溶液和正己烷—醋酸乙酯—二乙胺（11∶14∶1∶5）两个溶剂系统作为鉴别湖北贝母、川贝母、平贝母、浙贝母和伊贝母薄层色谱法的溶剂系统,通过谱图可知伊贝母中含有西贝母碱,无贝母素甲和贝母素乙,而其他四种贝母则含有贝母素甲和贝母素乙,无西贝母碱.吴晓民等[6] 运用薄层色谱法对不同品种、产地、采收期的平贝母和伪品之间进行了比较和分析,其结果显示,不同采收期及不同产地的平贝母谱图相近,而不同品种的平贝母和平贝母伪品的谱图之间有着明显差异,所以采用薄层色谱（TCL）鉴定法可以对平贝母药材的鉴别提供有利依据.
4 分子标记鉴定
从分子遗传学角度来看,基因型的差异是物种表现型的主要差异,即DNA 序列上的差异,这种差异是个体的差异并且不受环境影响,所以通过对基因型差异的比较研究也能进行植物分类和鉴定.同时随着新科学技术的不断发展创新,出现了分子生物学鉴定方法,所以通过分子标记技术对中药基原植物及其饮片鉴定得到了极大的发展.
4.1 随机引物扩增多态性DNA(RAPD)
李玉锋等[7]运用RAPD 技术分析了8 种贝母其基因组DNA多态性以及构建了树状聚类图,结果显示亲缘关系最近的为产地相同的川贝母和康定贝母,但产地不同的伊贝母、浙贝母、平贝母与川贝母等相同产地的贝母遗传距离相对较远.因此可知,地理的分布距离越小,贝母的遗传差异性越小,反之则越大.尹春萍等[ 8]对暗紫贝母和湖北贝母采用RAPD 法筛选出特异性高的引物进行准确区分.龚伯奇[ 9] 通过RAPD技术进行分析了青海省四个地区的暗紫贝母遗传多样性,通过获得的多态性信息将每个样地的样品准确地将聚类在一起.周洁[ 10] 采用RAPD 标记和ISSR 标记相结合的技术对12个浙贝母的品种进行了分子鉴定,将地种植的贝母类群和磐安引种贝母划分开,发现了RAPD 的聚类结果与ISSR 标记得到的聚类结果基本一致,从而肯定了RAPD 技术的鉴定准确性.
4.2 简单重复区间标记技术（inter-simple sequencerepeat,ISSR）
通过对SSR 技术进行改进后得到了新型分子标记技术,ISSR 技术是以SSR 序列为引物并在3´ 端或者5´ 端加上2～4个随机核苷酸,PCR 过程中使锚定引物引起特意位点的退火,使重复序列间DNA 片段成功扩增.因为不同物种、不同品种的SSR 在基因组中的位置和数量均具有差异性,所以扩增结果将不同,这种结果又叫做多态性[11].刘晓贤等[12]对2 个川贝母居群、1 个皖贝母居群、1 个东贝母居群和8 个浙贝母居群采用ISSR-PCR 技术进行分析,结果表明和其他产区浙贝居群相比,磐安地区的浙贝居群有明显的区别,且长期的留种栽培使磐安浙贝遗传多样性水平降低,所以形成了相对稳定的遗传.王果平等[13-14] 运用ISSR 技术对新疆贝母属的遗传多样性进行聚类分析,把十种贝母分成三个类群.结果表明聚类在一起的为托里贝母、黄花贝母、小白花贝母和大白花贝母.赵鑫等[15]探究了Mg2+ 浓度、引物、dNTP 和TagDNA 聚合酶用量这四个要素对伊贝母ISSR-PCR 扩增的影响,并确定了伊贝母ISSR 反应体系,这对其他贝母属药用植物的ISSR反应体系的建立具有指导作用.
4.3 DNA 条形码技术鉴定
通过选取进化速率较快、普遍性高以及种内遗传较为稳定的DNA 序列,设计相对应的引物,使用PCR 技术扩增出待鉴定物种对应DNA 片段序列,通过直接测序的方法获得序列信息,并运用MEGA 等软件比对序列信息,便能对其进行物种鉴定和系统发育构件,这种技术称为DNA 条形码技术.这种技术具有操作简单,重复性强,不受样品个体差异和环境影响,鉴定效率高等优点[16].余超等[17-19] 在贝母属植物中采用DNA 条形码技术从8 个贝母属21 个样品中提取了基因组DNA,进行ITS1、ITS2 序列的PCR 扩增和测序,并比较了各样品DNA 提取率、PCR 扩增率及测序成功率.最终测序数据经过BLAST 搜索法评价、SPSS 软件分析及MEGA 软件的构建,其结果表明ITS2 序列能够更准确鉴定不同物种贝母,适合作为贝母属植物的通用条形码序列.谭莹等[20-21]通过研究建立了川贝母DNA 指纹鉴别方法,结果显示川贝母能扩增出的片段可达到274 bp,而其余贝母均未扩增出相应片段.由于此种方法具有简便、快速及结果可靠的优点,所以可作为川贝母及其伪品之间鉴定的有效手段.李敏等[22] 对浙贝母Fritillaria thunbergii 通过特异性引物进行特异性PCR 鉴定,结果显示浙贝母在约750 bp 处出现特异性条带,其他贝母品种属则未出现相应条带.罗焜等[23]也使用ITS2 序列技术对川贝母基原植物及其混伪品进行了准确区分,并将太白贝母、梭沙贝母、瓦布贝母、暗紫贝母、卷叶贝母、甘肃贝母这六种不同的川贝母基原植物聚类在一起,验证了药典的准确性.
4.4 其他分子标记技术
主要通过对编码蛋白质的mRNA 进行逆转录,同时构建物种cDNA 文库,通过ESTs 图谱区分基因水平的差异,这种技术叫做表达序列标签( expressed sequence tags,ESTs) 技术.现今,在川贝母的cDNA 文库中,已经有超过1343 个独特的转录组和超过2158 条高品质的ESTs 序列信息[24].目前发现的川贝母生化活性相关的转录集合主要包括氨基酸转移酶、FPSs、CYP450s、HMGR 等数十个,为贝母甾体生物碱合成相关的转录组基因鉴定技术提供了进一步的支持[25].
5 傅里叶变换红外光谱法FTIR
利用FTIR 中的OMNI 采样器直接测定药材红外光谱,可减少萃取或粉碎过程中增加的不确定因素,增大结果的可信度.程存归等[26]通过本方法对小东贝、珠贝和川贝母进行鉴别,结果表明芯芽的红外光谱是三者之间最大的区别.叶晓镭等[27]采用本方法对甘肃贝母、暗紫贝母等26 种贝母类药材及其伪品进行分析鉴定,其结果显示对于区分不同种类的贝母及其伪品时本方法是准确可行的.
6 高效液相色谱法
张国欣等[28]运用高效液相色谱法建立并分析了湖北贝母的指纹图谱.李玉锋等[29]通过指纹图谱研究显示,贝母素甲是贝母类药材主要的生物碱之一,但是含量在不同贝母之间差别比较大,本研究有助于贝母指纹图谱的建立.蔡晓翠等[30]对10 批不同种植区的伊贝母通过HPLC-ELSD 指纹图谱进行研究,发现色谱峰整体特征具有很高的相似度,伊犁不同产区的伊贝母中西贝母碱含量有着显著的差异,并且在同一产区不同采收期其西贝母碱含量也存在着差异.
周建良等[31]运用快速液相色谱对产于不同地区浙贝母的主要成分特征图谱进行比较分析,强调了在高度精确的定量分析基础上各药材之间含量及化学成分上的差异,可作为不同贝母品种的区分依据以及为药材的规格、品级和同种采收季节和药材地提供定量数据支持.贺美艳等[32,33]采用高效液相色谱法对浙贝、川贝、平贝、新疆贝母中鸟苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷的含量进行检测,最终确定尿嘧啶能够与鸟苷、尿苷、腺苷线性良好,同时达到基线分离,指标成分含量在四种贝母中具有显著的差异.
7 三相静态萃取HPLC 鉴定法
于海英等[34]采用不同洗脱梯度、同一流动相系统,通过液—液—液三相静态萃取技术制备样品的方法,测定五种贝母的不同萃取馏分,其中极性萃取馏分的谱图基线、分离度及对称性较好,从而确定可以采用三相静态萃取HPLC 鉴定法对贝母类药材进行鉴定及相关质量评价.
8 近红外漫反射光谱法
邓波等[35]对东北平贝母、浙贝母、川贝母的48 个样品通过近红外漫反射光谱和主成分分析法相结合的方法进行分析,最终发现近红外漫反射光谱分析法可以较好地表征48 个样品的类别关系,从而确定近红外漫反射光谱法可用于鉴定及区分贝母类药材.高越等[36] 对十种贝母药材通过褶合变换- 可视化- 相似系数分析、近红外漫反射光谱并和聚类分析等相结合的方法进行分析,结果显示聚类分析可将3 种贝母伪品和7 种贝母正品区别开来,褶合变换- 可视化- 相似系数分析方法则可以更详细的区分贝母正品之间的微小差异,从而改善了正品贝母之间的鉴别效果,同时为贝母正品之间的鉴别提供有利依据.
9 热分析法
王书军等[37]对九种贝母类药材进行热分析,并得出结论,不同的气候,不同的地理环境和不同来源的贝母的热分析图谱之间存在显著差异.其中平贝母与湖北贝母的差热图谱有明显差异,平贝母的热稳定性最差,而湖北贝母的热稳定性最高.因此可以通过贝母类药材热分析图谱的差异,更简单的对其进行鉴别与区分.
10 X 射线粉末衍射法
王书军等[38]对五种贝母类药材通过X 射线衍射进行了分析测定,通过对谱图分析可知,湖北贝母、伊贝母、平贝母和浙贝母中淀粉属于B 型,川贝母中淀粉属于CB 型,且五种贝母的粉末结晶度完全不同,因此可运用X 射线粉末衍射图谱分析、药材本身淀粉颗粒的晶体类型和药材中粉末结晶度相结合的方法,进行贝母类药材的分析鉴别.
11 电喷雾质谱法
韩凤梅等[39] 通过电喷雾离子阱质谱法对五种贝母中贝母生物碱进行分析,通过五种贝母对照药材的总生物碱提取液的一级电喷雾质谱图谱可知,这五种贝母主要的分子峰和离子峰基本相同,但是相对丰度差异较大.其结果显示五种贝母类药材生物碱提取物的电喷雾质谱图谱特征性较强,并且它们的精密度和重现性也较好,所以可通过此方法对不同贝母类药材进行鉴别.
12 结语
通过对近十年贝母类药材的鉴别进行归纳总结可以看出：贝母类药材鉴别方法已经从传统的性状鉴别向经典的显微鉴别发展,从现代的光谱、色谱理化鉴别技术向DNA 条形码和多态性分析等为特征的分子水平延伸.同时随着生物技术的不断发展进步,SNP 技术、ESTs 技术、系统生物学技术和基因芯片技术能为贝母类药材研究提供有力的帮助.因贝母类药材分布广泛,同时具有良好的药用价值,市场的需求量大,所以建立完整的贝母类药材鉴定,对该类药材的市场监管具有极其重要的意义.
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